Den rolle Epidermal Endothelin Cascade i Hyperpigmentering mekanisme af Lentigo senilis<br><br>Satsuki Kadono, Izumi Manaka, Makoto Kawashima, Takashi Kobayashi og Genji ImokawaReceived 17. juli 2000 Revideret 29 December 2000; Accepteret 8 januar 2001.<br><br>Toppen af pageAbstractLittle er kendt om den mekanisme (r) underliggende hyperpigmentering i lentigo senilis. Vi har tidligere rapporteret, at keratinocytederived endothelinerne er iboende parakrine mitogener og melanogens for menneskelige melanocytter, og at de spiller en væsentlig rolle i at stimulere ultravioletBinduced melanogenese. I denne undersøgelse har vi anvendt immunhistokemi og revers transkriptase polymerasekædereaktion analyse til at klarlægge rolle endothelin kaskade, herunder endothelin produktion,ugg bambini, forarbejdning af endothelinconverting enzym, og ekspression af endothelin B-receptoren, i hyperpigmentary mekanisme (r) er involveret i lentigo senilis. Antallet af tyrosinase immunopositive melanocytter i lentigo senilis lesional Huden blev forøget 2fold over perilesional epidermis. Immunhistokemi under anvendelse af antistoffer til endothelin1 viste relativt stærkere farvning i lesional epidermis end i perilesional epidermis. Revers transkriptase polymerasekædereaktion analyse samtidigt demonstreret forstærket ekspression af transkripter for endothelin1 og for endothelin B-receptor i lentigo senilis lesional hud, som blev ledsaget af en tilsvarende forstærket ekspression af tyrosinase mRNA sammenlignet med perilesional kontrol. Den endothelin1inducible cytokin, tumor nekrose faktor, blev konsekvent opreguleret i lentigo senilis lesional epidermis som fastsat på transcriptional plan og ved immunfarvning, mens interleukin1 var nedreguleret. I modsætning hertil blev endothelinconverting enzym 1-mRNA ikke væsentligt forøget i lesional epidermis. Disse resultater antyder, at en fremhævelse af den epidermale endothelin kaskade, navnlig med hensyn til ekspression af endothelin og endothelin B-receptoren, spiller en vigtig rolle i mekanismen involveret i hyperpigmentering af lentigo senilis.<br><br>Nøgleord: endothelin B-receptor, interleukin1, tumor nekrose faktor<br><br>Forkortelser: ECE, endothelinconverting enzym, ET, endothelin, ETBR, endothelin B receptor; LS, lentigo senilis, SCF, stamcelle faktor<br><br>Lidt er kendt om biologiske mekanismer, som melanocytter aktiveres til at producere store mængder af melanin i forskellige hyperpigmentary lidelser. Nyere beviser har antydet, at melanocyt funktion er reguleret af flere cytokiner, der udskilles af omgivende epidermale celler (keratinocytter) i en parakrin måde. I ultraviolet B (UVB) induceret pigmentering, er humane keratinocytter udsættes for UVB stimuleret til at producere og udskille vasokonstriktive peptider, kaldet endothelinerne (ETS), der udløser aktivering af melanocytter og fungerer som potente mitogener og melanogens for menneskelige melanocytter (Yada mfl., 1991; Imokawa m.fl., 1992,1995,1996 a, 1997). Tilsvarende har UVAinduced pigmentering vist sig at være medieret ved virkningen af en anden mitogen for humane melanocytter, betegnet granulocyt / makrofag kolonistimulerende faktor (Imokawa et al 1996b). I allergiccontactdermatitisinduced hyperpigmentering, har vi for nylig fundet, at chemokiner såsom growthrelated onkogen, produceres og udskilles af epidermale celler under allergiske inflammatoriske tilstande, hvilket resulterer i stimulering af melanocytter (Imokawa et al, 1998). Der foreligger ingen oplysninger om cytokiner afgørende for at stimulere melanin af melanocytter i stimulerede epidermale hyperpigmentary lidelser, dog.<br><br>Lentigo senilis (LS) er den hudens tilstand af fælles aldrende spots med accentueret epidermal pigmentering. Baseret på den observation, at et stort antal melaninproducing melanocytter er placeret i nærheden af stærkt prolifererende keratinocytter, som det ses i hårsækkene, vi antager, at de prolifererende keratinocytter i LS udløser aktiveringen af tilstødende melanocytter ved at udskille melanocytestimulating cytokiner. Som, blandt de kendte keratinocytederived cytokiner produceres som reaktion på deres proliferation, ET1 er den eneste cytokin der har dobbelt stimulerende virkninger på DNA-syntese og melanin af humane melanocytter (Yada et al, 1991; Imokawa et al 1996a, 1997), er det af stor interesse for at afklare, om ET produktion og sekretion er forstærket i overhuden af LS. Endvidere ET sekretion er kendt for at være reguleret af endothelinconverting enzym (ECE1), som omdanner propeptidet, Biget, til dets aktive form, ET1 (Xu et al, 1994). Ud over ET produceres og udskilles af keratinocytter, er ET handling på melanocytter medieres via endothelin B-receptor (ETBR), som er en Gproteincoupled transmembranreceptor (Tada et al, 1998).<br><br>SamplesSkin biopsi prøver blev indhentet fra patienter med LS (n = 19, japansk, seks mænd, 13 kvinder) og perilesional hud blev betragtet som nonlesional normal hud. Disse patienter var i alderen 45 til 80 y gamle (gennemsnit 62 år). De steder for hud excisions var i maven, underben, balder og ryg, der normalt sunprotected hudområder, og der var ingen symptomer på udsættelse for sol, da biopsier blev taget. Den vigtigste del af hver prøve blev underkastet rutinemæssig histopatologisk undersøgelse. Yderligere eksempler prøver blev indlejret i TissueTek OCT-forbindelse (Miles, IN), snapfrozen i flydende nitrogen og derefter lagret ved 80 indtil anvendelse.<br><br>ImmunohistochemistryCryostat sektioner (4 m tyk) blev lufttørres, fikseret i kold acetone, og efter vask i 0,01 M phosphatebuffered saltvand (PBS), inkuberet i 3% H2O2 i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter yderligere vask i 0,01 M PBS blev snittene inkuberet med protein-blokerende middel i 20 minutter ved stuetemperatur. Snittene blev derefter vasket igen i 0,01 M PBS og inkuberet natten over ved 4 i 0,01 M PBS, pH 7,2, med antistoffer mod ET1, TNF, eller IL1 (1:50). Efter yderligere vask i 0,01 M PBS blev snittene inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med kanin-IgG-antistof, vaskes igen i 0,01 M PBS, og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med standard Omnitags streptavidinperoxidase. Reaktionen blev derefter udviklet med aminoethylcarbazole (AEC). Snit blev inkuberet i 1015 minutter ved stuetemperatur med Omnitags plus / HRP kit (bestående af to dråber natriumacetatpuffer, to dråber AEC chromogen koncentrat, og to dråber 3% H2O2 i destilleret vand), vasket i PBS, og farves med hematoxylin og eosin.<br><br>Påvisning af ECE1, ET1, ETBR og tyrosinasegen udskrifter i dyrkede celler eller human epidermis fra LS og perilesional normale skinBiopsy prøver blev indhentet fra LS og perilesional hud som beskrevet ovenfor. Den epidermisarket af hver prøve blev separeret ved opvarmning i 34 min ved 60 Resten af separeret væv blev undersøgt efter periodisk acidSchiff farvning og vi bekræftede, at adskillelsen fandt sted i epidermis, efterlader ingen dermale komponenter på epidermisarket. Totalt cellulært RNA blev ekstraheret fra dyrkede humane keratinocytter, endotelceller, fibroblaster og melanocytter, eller fra det separerede epidermis, ved syre guanidinium phenol chloroform med kun en enkelt udfældning. RNA blev kvantificeret ved måling af den optiske densitet ved 260 nm. Ca. 1 g totalt RNA blev opnået fra hver vævsprøve. At syntetisere oligo (dT16) primede cDNA, total RNA blev opvarmet til 65 i 3 minutter, og derefter afkølet på is. Revers transskription blev udført i 20 l reaktionsblandinger indeholdende 2 l 10 PCR-buffer II 4 l MgCl2 (25 mM), 1 l oligo (dT16) (50 M), 8 l deoxynucleotider (2,5 mM hver), 1 l RNase-inhibitor ( 20 E pr liter), 1 l Moloney murin leukæmi-virus revers transkriptase (50 U pr liter), og 3 l-RNA (300 ng i DEPCtreated vand). Reaktionsblandinger blev inkuberet ved 42 i 60 min og 52 i 30 minutter,manteau moncler femme, og derefter opvarmet til 99 i 5 min for at inaktivere den omvendte transkriptase. Til PCR amplifikation blev 2 l af cDNA reaktionsblanding sættes til 8 liter af en 80 l PCR blanding indeholdende 4 l MgCI2 (25 mM), 8 l 10 PCR-buffer II, 1 l hver af de 3 'og 5' primere ( 20 M hver), og 0,5 l Taq-polymerase (Cetus). Reaktionsblandinger blev overlejret med mineralolie og derefter amplificeres ved hjælp af en PerkinElmer / Cetus thermal cycler. PCR cyklus betingelser blev smelte i 1 minut ved 95 annealing i 1 minut ved 60 og udvidelse i 2 minutter ved 72 Reaktionsprodukter (5 l) blev opløst på 1% 1.5% agarosegeler og blev visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. Primere til ET1, tyrosinase, og glyceraldehyde3phosphate (GAPDH) blev syntetiseret på et DNA-synteseapparat (Applied Bio Systems). Sekvenserne af 3 'og 5' primerpar anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel I. Som negative kontroller, gennemførte vi PCR uden revers transkriptase og bekræftede, at der var nogen forstærkning af transkripterne. At kvantificere ekspressionen af transkripterne, blev intensiteten af PCR bånd målt ved densitometri og udtrykkes som intensiteter i forhold til GAPDH.<br><br>Top of pageResultsETBR genekspression i humane keratinocytter og melanocytesTo undersøge, om ETBR genet udelukkende udtrykkes af menneskelige melanocytter blandt de forskellige typer af epidermale celler, vi brugte RTPCR at sammenligne niveauet af udtryk for dette gen ved humane keratinocytter, melanocytter, fibroblaster, og endotelceller i kultur. RTPCR analyse af ETBR mRNA demonstreret sin særegne eller svag ekspression af humane melanocytter eller endotelceller, henholdsvis, men ikke ved humane keratinocytter og humane fibroblaster (figur 1).<br><br>Fuld figur og legende (32K)<br><br>Melanocyt populationTo afgøre, om den epidermale hyperpigmentering af LS er forbundet med en øget udbredelse af melanocytter, vi først studerede population af melanocytter ved at måle deres tal efter immunfarvning med et tyrosinase antistof. Immunofarvningen afslørede immunreaktivitet lokaliseret til et par dendritiske celler langs den basale lag (figur 2), hvilket tyder på en øget proliferation af melanocytter i LS epidermis. Kvantificering langs grænsefladen mellem epidermis og dermis viste,prezzi ugg, at antallet af tyrosinase immunopositive melanocytter blev forøget 2fold i lesional LS overhuden sammenlignet med den perilesional epidermis (figur 3). (A) Lesional hud (180), (B) nonlesional huden (180).<br><br>Fuld figur og legende (21K)<br><br>ET1, ECE1, IL1, TNF, og EtBr gentranskripter i LSTo undersøge, om den øgede melanogenese var forbundet med accentuering af ET kaskade i LS, undersøgte vi udtryk for ECE1, ET1 og EtBr gener ved hjælp RTPCR. Analyse af ET1 mRNA viste en forøget ekspression (gennemsnit 3.6fold, n = 6) af ET1 transkriptet i LS hud sammenlignes med den i perilesional normal hud (figur 4), og der var også en markant stigning (gennemsnit 2.3fold, n = 7 ) i tyrosinase transkripter i lesional LS huden (figur 5). Da produktionen af ET1 biologisk reguleres af ECE1 (Xu et al, 1994), vi afgøres, om den ECE1 afskrift blev også opreguleret i LS, hvilket ville resultere i øget udskillelse af ET1. RTPCR analyse af ECE1 mRNA imidlertid afsløret nogen væsentlig forskel i udtrykket (gennemsnitlig 1.3fold, n = 4) i ECE1 udskrift i lesional LS huden (figur 6). Som IL1 og TNF er kendt som ET1inducible cytokiner i dyrkede humane keratinocytter (Imokawa et al, 1992; Tsuboi et al, 1994), har vi også undersøgt ekspressionen af IL1 (n = 2) og TNF mRNA (n = 3) i LS epidermis. RTPCR af disse mRNA viste et fald (gennemsnitlig 3.8fold, n = 2) og en stigning (gennemsnit 5.5fold, n = 3) i ekspressionen af IL1 og TNF henholdsvis i lesional LS epidermis (figur 7, figur 8) , hvilket antyder inddragelsen af TNF som en primær cytokin i udprægede produktion af ET.
相关的主题文章:
- http://www.i-lab.fr/images/large/Asics/Asics-Corrido-Schuhe-03_LRG.jpg
- http://www.trouverungite.fr/images/large/Supra/Supra-Skytop-NS-Shoes-Footwear-137_LRG.jpg
- http://www.monclerjackesale2k13.eu/images/moncler/ion-Down-Weste-For-Herren-Hooded-Grey186_LRG.jpg
- http://www.converseskotilbud2k13.com/
- http://www.ultrabay.eu/images/large/UGG/UGG-Classic-Shortbo94ot0165-165_LRG.jpg
