l'analyse de méthylation d'ADN du cerveau autiste révèle de multiples voies biologiques dérégulées<br><br>analyse de la méthylation du cerveau autiste révèle pathwaysCorrespondence biologique dérégulée multiple: Dr E Elliott, Faculté de médecine, Université Bar Ilan, Hanrietta Vendu 8, Safed 13215, Israël. Les facteurs génétiques et environnementaux ont été impliqués dans le développement des TSA, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents de leur interaction ne sont pas claires. Les modifications épigénétiques ont été suggérés comme mécanisme moléculaire qui peut servir de médiateur de l'interaction entre l'environnement et le génome pour produire des comportements adaptatifs ou mésadaptés. Ici, en utilisant la Illumina 450 méthylation ensemble nous avons déterminé l'existence de nombreux CpG dérégulés dans deux régions corticales, l'aire de Brodmann 10 (BA10) et Brodmann zone 24 (BA24), des personnes qui avaient ASD. En BA10 nous avons trouvé un enrichissement très important pour les zones génomiques responsables des fonctions immunitaires chez les CpG hypométhylée, tandis que les gènes liés à la membrane synaptique ont été enrichies basket air jordan parmi CpG hyperméthylés. En comparant les données de nos méthylome avec des données de transcriptome publiées précédemment, et en effectuant la PCR en temps réel sur les gènes sélectionnés qui ont été dérégulé dans notre étude, nous montrons que les gènes hypométhylée sont souvent surexprimés, et qu'il ya une corrélation inverse entre l'expression des gènes et la méthylation d'ADN dans les les individus. Parmi ces gènes, il y avait C1Q, C3 ITGB2 (C3R), et TNFIRF8 SPI1, qui ont récemment été impliquée dans l'élagage synaptique et la spécification des cellules microgliales. Enfin, nous avons déterminé la dysrégulation épigénétique du HDAC4 gène, et nous confirmer que le locus englobant C11orf21 a plusieurs CpG hypométhylée dans le cerveau autiste, comme démontré précédemment. Nos données suggèrent un rôle possible pour les processus épigénétiques dans l'étiologie des TSA.<br><br>Haut de troubles du spectre pageIntroductionAutism (TSA) sont définis par des anomalies généralisées dans les interactions sociales et la communication, et par la présence d'intérêts très restreints et behaviors.1 répétitif stéréotypée Il est considéré comme une condition hautement héréditaire caractérisée par une hétérogénéité génétique marquée et phénotype variables , allant de légère à une symptomatologie grave. L'étiologie des TSA est principalement attribuée à différentes variantes génétiques telles que nombre de copies variations, polymorphismes nucléotidiques simples et seulement récemment, de novo mutations.2,3 Malgré sa forte composante génétique, plusieurs lignes de preuves suggèrent que les facteurs environnementaux peuvent avoir un rôle majeur dans le développement des TSA. facteurs environnementaux putatifs qui ont été corrélées aux TSA occurrence comprennent l'hospitalisation maternelle pour les infections virales au cours du premier trimestre de la grossesse9 et l'exposition prénatale au sodium valproate.10 D'autres facteurs, comme les médicaments, les polluants et plusieurs xénobiotiques sont suspected.11 fortement Par conséquent, les changements moléculaires qui sont impliqués dans le développement des TSA sont susceptibles d'être réglementés par des mécanismes qui sont, en partie, modulés par des signaux environnementaux. Dans ce scénario, les mécanismes épigénétiques, tels que la méthylation de l'ADN mbt outlet ufficiale et les histones modifications, pourrait être le entre les influences de l'environnement et le phénotype manifeste à travers la régulation de l'expression génique.<br><br>Le développement du cerveau est un processus complexe qui nécessite plastique expression régulée d'ensembles de gènes spécifiques dans un espace de manière coordonnée temporelle. Cette tâche est accomplie par des facteurs de transcription et de la machinerie épigénétique. Les modifications épigénétiques des deux protéines d'ADN et d'histones apparaissent comme des mécanismes fondamentaux par lesquels les neurones adaptent leur réponse transcriptionnelle au développement et de l'environnement cues.12 dysrégulation de ces mécanismes, causée par une insulte génétique ou environnementale, peut se traduire par un déficit cognitif et d'autres caractéristiques typiques des disorders.13 neurodéveloppemental intérêt particulier, des études de séquençage du génome humain et dans le développement neurologique des troubles psychiatriques ont découvert des mutations dans de nombreux regulators.13 chromatine Par exemple, la mutation dans la méthyl scarpe mbt milano CpG protéine de liaison 2 (MECP2), un produit de protéine qui se lie CpG méthylés, provoque Rett syndome, un trouble avec un chevauchement phénotypique considérable avec ASD.14 par conséquent, il existe un lien direct entre la machine connectée à méthylation de l'ADN et autiste comme comportement. Bien que génome récente analyse large fournir des preuves pour des modifications épigénétiques dans le sang, les cellules ectodermiques et en post-mortem michael kors clearance ASD cerveau, le champ n'a pas une enquête systématique montrant une implication directe de la méthylation de l'ADN et corrélative dysrégulation de l'expression des gènes dans le développement de ASD.15, 16, 17 18<br><br>L'objectif central de cette étude est de déterminer les génomes de larges motifs de méthylation d'ADN dans l'autisme cerveau et la signification de méthylation de l'ADN dysrégulation dans le développement de la maladie. À cette fin, nous avons analysé deux zones du cerveau, le cortex préfrontal (Brodmann Area 10; BA10) et le gyrus cingulaire antérieur (Brodmann Area 24; BA24), qui ont été précédemment liées aux TSA par l'état de repos imaging.19 par résonance magnétique fonctionnelle, 20<br><br>Haut de pageMaterials et des échantillons de tissus samplesBrain de tissus methodsBrain de 13 cas d'autisme et 12 contrôles ont été obtenus auprès du Programme des tissus autisme. Tous ces échantillons ont été reçus de la Banque Harvard cerveau, sauf pour deux échantillons de cerveau autistes obtenus à partir de la parajumpers pas cher homme Banque de cerveaux du Royaume-Uni pour l'autisme (Université d'Oxford). Pour chaque cerveau, le tissu a été obtenu à partir du cortex préfrontal (BA10) et le gyrus cingulaire antérieur (de BA24), lorsqu'elles sont disponibles. Dans l'ensemble nous avons eu quatre groupes distincts: 12 cas d'autisme et 12 témoins pour BA10, et 11 cas d'autisme et 11 témoins pour BA24 (tableau supplémentaire 1). concentration d'ARN a été évaluée par un spectrophotomètre NanoDrop et 1 de l'ARN total a été une transcription inverse en utilisant le kit de haute Capacité ADNc transcription inverse (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Toutes les amorces utilisées ont été conçues en utilisant BLAST Primer et testés pour l'efficacité grâce à une courbe standard. Des gènes ayant plus d'une isoforme, des amorces ont été conçues pour englober tous. Toutes les séquences d'amorces sont énumérées dans le tableau complémentaire 2. La stratégie utilisée pour la normalisation des données quantitatives RT à partir de gènes humains est la moyenne géométrique human hair extensions de plusieurs gènes de contrôle interne selon le Vandesompele et coll.21 méthode. Nous avons utilisé quatre gènes de ménage (GAPDH, HPRT1, POLR2a et SDHA) qui représentent un contrôle précis pour l'analyse de l'expression de l'ARNm du post-mortem samples.22 du cerveau Pour chaque gène d'entretien, nous avons mesuré la stabilité du gène (M de michael kors watches outlet valeur) et classés en utilisant l'algorithme de geNorm .21<br><br>L'extraction d'ADN et microarrayGenomic ADN a été extrait à partir de tissu approximativement 25 d'azote liquide pulvérisé en utilisant le kit QIAamp DNA Mini (Qiagen). concentration de l'ADN génomique a été évaluée par Qubit 2.0 Fluorometer utilisant le Qubit dsDNA Broad RangeAssay. échantillons d'ADN ont été soumis à la Facilité de génomique de base de l'Institut Rappaport Family pour la recherche en sciences médicales (Haifa, IL, USA), et traitées par la procédure suivante. Pour chaque individu, l'ADN génomique (500 extrait de tissu cérébral a été traité avec du bisulfite de sodium en utilisant le kit de méthylation d'ADN EZ96 (Zymo Research, Irvine, CA, USA) en suivant le protocole standard du fabricant. La réaction de conversion au bisulfite a été réalisée en double pour chaque échantillon pour minimiser les biais potentiels causés par l'efficacité de conversion variable, et bisulfite groupé ADN traité a été utilisé pour l'analyse du tableau suivant. Génome large méthylation de l'ADN a été évaluée par le Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), qui interroge le profil de méthylation d'ADN de plus de 485 sites de méthylation par échantillon à la résolution d'un seul nucléotide. les tableaux ont été scannés par HiScan 2000 (Illumina). logiciel Illumina GenomeStudio (Illumina) a été utilisé pour extraire les intensités de signal pour chaque sonde et d'effectuer des vérifications initiales de qualité de contrôle. contrôles Illumina interne étaient utilisé pour évaluer la qualité de la coloration, l'extension, l'hybridation, conversion au bisulfite et de spécificité. Les données des microréseaux ont été déposés dans le NCBI GEO (GSE53924).<br><br>Méthylation microarray analysisRaw de données des valeurs de méthylation ont été normalisées en utilisant pipeline sous-ensemble de normalisation quantile pour corriger Infinium I et polarisation II, le biais de la couleur, la correction de fond, seule variation de polymorphisme nucléotidique, positions allosomal et le bruit de perles filtering.24 Toutes les analyses informatiques et statistiques supplémentaires ont été effectuées à l'aide JMP Genomic V6 (SAS Software). En raison de la normalisation étendue, environ 0,05 de tous les points de données avaient une valeur supérieure ou inférieure à 0. Par conséquent ces points de données ont été ajustées à 1 ou 0 puisque cet écart pourrait provoquer changement important dans les résultats qui ont aucune pertinence biologique. Malgré le sous-ensemble normalisation quantile 5 de la variance était encore en raison des différences de traitement par lots entre michael kors uk stores les quatre puces. Utilisation de JMP Genomics batch normalisation cette variation a été corrigé. En outre, en raison de herve leger dress sale la forte incidence du sexe sur méthylation de l'ADN, le genre de normalisation a été effectuée. Nous avons testé 12 sites CpG liés à quatre loci de gène différent (C11orf21 CTSZ, C1qA, IRF8) qui démontrent une grande valeur de méthylation significative dans l'autisme par rapport à des groupes témoins en BA10. échantillons d'ADN ont été soumis à l'École de médecine et de dentisterie du centre de génomique Barts et le London (Londres, Royaume-Uni) et traités par la procédure suivante. En bref, 500 ADN de chaque individu a été traitée avec du bisulfite de sodium en utilisant le kit de méthylation de l'ADN EZ96 selon la recommandation du fabricant, et amplifié par une réaction en chaîne par polymérase bisulfite. L'analyse quantitative de la méthylation de l'ADN de chaque CpG a été réalisée à l'aide PSQ96 Pyrosequencer (Qiagen). coordonnées génomiques et des amorces de séquençage pour chaque single CpG sont énumérés dans le tableau complémentaire 4.<br><br>Haut de pageResultsTo déterminer le génome large signature de méthylation d'ADN dans le cerveau des autistes, nous avons analysé deux régions corticales, le cortex préfrontal (BA10) et le gyrus cingulaire antérieur (de BA24) de personnes ayant une DJA R ont confirmé le diagnostic de l'autisme et des témoins appariés. L'ADN est extrait à partir de 12 et 11 BA10 BA24 échantillons de cerveau provenant des deux golden goose outlet groupes témoins et l'autisme, pour un total de 46 échantillons. Il n'y avait aucune différence significative dans l'âge et les intervalles post-mortem entre l'autisme et de contrôle des échantillons de cerveau. L'ADN a été converti avec du bisulfite de sodium et on a sondé avec la méthylation matrice Illumina 450. Afin de valider la reproductibilité de l'essai, nous avons sondé un bisulfite de sodium converti échantillon sur deux lots différents de puces à ADN et les deux conversions de bisulfite de sodium sur les deux microréseaux différents pris dans le même lot. Dans les deux cas, les échantillons avaient très forte corrélation (coefficient de corrélation de Pearson, R2 (Figures supplémentaires 1a et b).<br><br>Nous avons effectué le filtrage des données de haute qualité qui ont conduit à l'exclusion d'un échantillon, la région de BA24 de AN04166 individuelle, en raison du faible rapport signal sur bruit dans l'échantillon. Conformément aux procédures de normalisation précédemment établies pour la méthylation gamme Illumina 450 (voir Matériels et Méthodes), nous avons mis les paramètres de coupure pour détecter les sites CpG méthylés différentiellement. Analyse de l'emplacement de voisinage a révélé que les sondes différentiellement méthylés ont été plus souvent dans les zones de faible densité CpG, et rarement dans les îlots CpG, par rapport à leur représentation sur la puce (figure 1c). En outre, l'analyse de la localisation génomique a révélé un léger enrichissement de sondes différentiellement méthylés dans les organes de gènes et une diminution significative du site d'initiation de la transcription (TSS) définie ici comme TSS200 (figure 1d). (A, b) la carte thermique des sites CpG méthylés différentiellement entre l'autisme et de contrôle des cohortes dans le cortex préfrontal (a) et le gyrus cingulaire (b). Les valeurs de méthylation Scaled sont codés par couleur selon la légende sur la gauche. La barre supérieure indique l'état de la maladie: le rouge, l'autisme; noir, contrôle. Le fond barres preuves supplémentaires variables pour chaque échantillon: sexe (gris, hogan sito ufficiale mâle, noir, femelle), comorbidité des saisies (vert, cas de l'autisme avec troubles épileptiques; rouge, cas de l'autisme sans trouble épileptique, le noir, le contrôle), l'âge, l'évaluation du pH et l'intervalle post-mortem (PMI). L'échelle correspondante pour les variables quantitatives est indiqué sur la chaussure nike tn pas cher gauche. (C, d) Les diagrammes circulaires représentant les quartiers et génomiques lieux de CpG représentés dans le microréseau (au milieu) et ceux différentiellement méthylés entre les contrôles et l'autisme en BA10 (à gauche) et BA24 (à droite). BA, zone Brodmann; FDR, le taux de fausses découvertes.<br><br>la figure pleine et la légende (313K)<br><br>Ensuite, nous avons analysé la distinction épigénétique entre les deux régions corticales. Nous avons constaté que, dans les cerveaux de contrôle, 51 sites CpG étaient différentiellement méthylés entre BA10 et BA24, ce qui démontre que le cerveau humain se différencie en zones distinctes épigénétique. En weft hair extensions comparaison, seulement 10 sites CpG ont été différentiellement méthylés entre les deux mêmes régions du cerveau dans le cerveau autiste (Figure 1E, Tableaux supplémentaires 7 et 8), qui est un écart très significatif à partir des résultats dans le cerveau de contrôle (test Z pour différence proportions, P pour exclure la possibilité que nos résultats étaient dus à un problème de seuil statistique, nous avons appliqué des critères plus stricts. Remarquablement, nous avons constaté que 2615 et 31 sites CpG ont été différentiellement méthylés entre BA10 et BA24 en autisme et de contrôle respectivement à une taux de fausses découvertes (P Pour avoir un aperçu statistique plus dans nos données, nous avons effectué une analyse en composantes principales, une méthode d'apprentissage non contrôlé qui ne connaît pas l'identité de chaque sample.25 les valeurs de la puce ont été projetés en composantes principales qui expliquent la source de variation des données (tableau complémentaire 9). N ° de composant principal une représente 51 la variation entre les données et présente un profil de chargement invariante parmi tous les échantillons, qui soutiennent la précision statistique de la puce à ADN (complémentaire Figure 2a). Principal numéro de deux composants, ce qui explique 3.7 de la variance, établit une distinction entre les deux régions du cerveau chez les sujets témoins (Figure 1f). Fait intéressant, une telle différenciation ne se produit pas dans le cerveau autiste. Cela étaye notre conclusion selon laquelle le cerveau autiste affiche une identité spécifique inférieure de la région, au niveau de méthylation de l'ADN, comme nous l'avons signalé ci-dessus. Ainsi, on peut émettre l'hypothèse d'un dysfonctionnement du programme de développement qui conduit à moins de distinction entre les régions corticales épigénétique dans l'autisme par rapport à la tête de commande.<br><br>Notre prochain objectif était de déterminer quel type de régions génomiques, en ce qui concerne la fonction biologique, étaient différentiellement méthylés entre le contrôle et les cerveaux autistes. les régions polo ralph lauren soldes hyperméthylés dans les échantillons de cerveau autistes appartiennent à la catégorie de la transmission synaptique des hogan outlet neurones, et comprennent DLG2, et DLGAP1 gènes DLGAP2 (figure 2b). En revanche, GO analyse de la BA24 a révélé un enrichissement beaucoup plus variées dans plusieurs processus biologiques indépendants, avec seulement un léger enrichissement de certaines fonctions immunitaires (figures complémentaires 3a et b). Fait intéressant, dans le BA10, il y avait un nombre significativement plus élevé de CpG qui ont été hypométhylé par rapport à ceux qui ont été hyperméthylés, alors qu'en BA24 nous ne détectons cette différence (Figure complémentaire 4). Par conséquent, dans le reste de cette étude, nous nous sommes concentrés sur la région BA10, tant en raison de sa signification bien établie au comportement autiste et à cause des changements très importants dans le système hogan outlet immunitaire et les catégories synaptiques, comme l'a révélé dans golden goose scarpe l'analyse GREAT. BA, zone Brodmann; FDR, le taux de fausses découvertes.<br><br>la figure pleine et la légende (136K)<br><br>Les données ont été analysées en outre pour déterminer si les gènes candidats autisme précédemment identifiés étaient fortement représentés parmi les régions du génome qui sont différentiellement méthylée dans nos échantillons. La base de données Initiative de recherche sur l'autisme Fondation Simons (SFARI) se compose d'une liste de gènes qui ont été liés à l'autisme par des études génétiques. Nous avons comparé notre liste de gènes qui affiche CpG différentiellement méthylés en BA10 des sujets autistes à une liste publiée des gènes provenant d'une vaste étude de transcriptome du génome qui a enquêté sur l'expression des gènes dans une région du cerveau très proche, BA9.27 Nous avons trouvé un chevauchement très important entre les gènes qui ont été hypométhylée dans notre étude en cours et ceux qui ont été surexprimé dans l'étude du transcriptome, alors il n'y avait qu'une tendance à un chevauchement entre les gènes qui ont été hyperméthylés dans notre étude et ceux qui ont été sous-exprimée dans l'étude du transcriptome (figure 2c, le tableau complémentaire 10 ). Fait intéressant, la réponse était la catégorie de GO qui a été plus important représenté tant dans le transcriptome et notre analyse de méthylome. Il convient de noter que notre étude a été menée sur BA10, tandis que les données d'expression de Voineagu et coll.27 appelés BA9 (une section voisine du cortex préfrontal), ce qui peut expliquer certaines des différences dans les résultats entre les deux études . Cependant, ces données suggèrent qu'il existe une forte relation entre hypométhylation et augmentation de l'expression des gènes dans le cerveau des autistes.<br><br>Afin d'étudier davantage la relation entre la méthylation de l'ADN et l'expression des gènes, nous avons effectué une analyse par RT sur un sous-ensemble de gènes qui affichent méthylation dérégulée sur plusieurs sites CpG. Nous avons constaté que des 17 gènes qui nous avons testés, 12 affichés expression différentielle entre les groupes témoins et de l'autisme (Figure 3, Figure complémentaire 5). Parmi ceux-ci, C1qA, C3 ITGB2, TNFIRF8, SPI1, PTPN6 et HLA DMB sont significativement surexprimés et montraient très significative corrélation inverse entre la méthylation de l'ADN et l'expression des gènes (figure 3, tableau complémentaire 11). Des 17 gènes que nous avons testés, 48 des 93 sites CpG affiche une corrélation significative entre les niveaux de méthylation et l'expression des gènes (tableau complémentaire 11). Cependant, parmi les 12 gènes qui présentaient l'expression des gènes dérégulée dans notre analyse par RT, la méthylation de l'ADN de CpG 42 sur 61 était significativement corrélée avec l'expression du gène. Par conséquent, un sous-ensemble de CpG peut avoir une influence significative sur l'expression génique. Nos données d'expression indique clairement la présence polo ralph lauren outlet online d'une réponse immunitaire altérée dans le cerveau autiste qui est bien corrélée avec une modulation épigénétique des régions génomiques pertinentes pour la fonction immunitaire. Pour renforcer cette hypothèse, nous avons exploré davantage le statut inflammatoire du cerveau des autistes en vérifiant l'expression de marqueurs inflammatoires classiques. Nous avons trouvé que l'IL 1b et IBA 1, un marqueur de l'activation des cellules microgliales, l'augmentation de l'autisme cerveau (Figure complémentaire 6); cela suggère la possibilité d'un processus de neuroinflammatoires. Pour répondre à la question de savoir si nos données de méthylation peuvent être affectés par des changements dans le type cellulaire hétérogénéité dans le cerveau des autistes, nous avons analysé si nos mbt outlet online CpG différentiellement méthylés se trouvent dans des régions qui sont connus pour être différentiellement méthylés entre les neurones et les cellules gliales, selon un récent scientifique report.28 Nous avons constaté qu'aucun des gènes que nous avons examinés dans cette étude sont parmi les régions. Analyse de l'expression génique de huit gènes hogan outlet milano liés au système immunitaire qui affichent plusieurs CpG hypométhylés dans le groupe de l'autisme (C3, C1qA, ITGB2, TNFIRF8, SPI1, PTPN6 et HLA DMB). Pour chaque gène, on montre l'analyse de l'expression des gènes (à gauche) et le coefficient de corrélation de Spearman (à droite) entre l'expression du gène d'un individu et le niveau de méthylation d'ADN. Tous ces gènes sont significativement surexprimés dans le groupe de l'autisme et afficher des corrélations inverses significatives entre les niveaux de méthylation d'ADN et les niveaux d'expression de gènes .
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hogan donne outlet L'analyse de méthylation de l'ADN du cer
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Posted 10 years ago #
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